Arnold实验室使用工程酶定向活化碳氢键

时间:2019-05-17 15:26:00     浏览量:
[文章摘自:微信公众号—合成生物催化剂]

作者:乐众乐 摘译
 
       许多有机化合物的合成需要指定一个特殊的碳-氢键来进行反应,但反应物中可能会存在多个稳定性相同的碳-氢键。因此,为了得到更好的区域选择性,往往会使用一个远程活化基团来辅助反应。手性内酰胺是许多生物活性物质的重要结构组成部分,也是药物化学中重点合成的对象。设计催化合成方案时遇到最大的挑战是既要从容易获取的羧酸延伸物开始反应, 又要能够调控氮宾插入的位置来获得不同成环大小的产物。来自Arnold教授实验室的Inha Cho及其课题组团队使用了酶的定向进化技术攻克了这个难题。研究团队制作了一系列自然界不存在的酶作为催化工具并作用于多种底物上,使得碳氢键的活化变得可控,从而生成多种有价值的内酰胺产物。
       课题组使用了细胞色素P450 单加氧酶。P450单加氧酶有着标志性的血红素辅基,可以用来催化区域选择性要求高的氧化反应,例如在没有被活化的碳氢键上进行羟基化反应。在自然界中,这一大类酶也参与了许多种氧化反应。在Jack Manning研究组的最近工作中,使用了原生的P450酶催化了脂肪酸基质中段的羟基化反应,这表明了在结构灵活底物上P450单加氧酶也能够达到非常高的区域选择性。
       许多人造新酶也是以像P450酶这样的血红素蛋白作为基础,能够催化除自然代谢以外的反应。前日,Arnold教授利用了分子定向进化技术编辑P450酶, 改造后的P411酶可以催化碳-氢键与磺酰基氮宾形成碳-氮键。 在Rochester大学Singh研究组的报告中,羰基氮宾也可以作为分子内碳氢键酰胺化反应的底物。
       羰基氮宾的使用为酰胺的合成开辟了先河,但它们非常容易分解,Inha Cho团队利用酶的定向进化来制造变异的p450酶,引导羰基氮宾进行选择性地酰胺化反应的同时阻止它们进行分解。由于 β-内酰胺在制药业中的广泛运用,Inha Cho团队把它作为了第一个合成对象。 他们选择了一个包含两个可反应碳-氢键的基质模型,其中一个碳氢键可在酰胺化后生成β-内酰胺,另一个碳氢键酰胺化后会生成δ-内酰胺。研究组在大肠杆菌内进行了一系列血红素蛋白酶的测试,包括原生P450酶以及之前提到的P411酶。在一种P411酶变体催化的样本中生成了少量的δ-内酰胺与β-内酰胺,产物并没有分解成对应的胺基化合物,因此作者将这种P411酶变体作为定向进化的母体来获得更好的催化效果。
       在四次定向进化试验后,其中一种酶变体(LSsp3) 催化的转换常数(TTNs)达到了223,000,产量达到了96%,立体选择性比例(r.r)达到了 25:1, 对映体过量百分数(ee) 达到了96%,产物中β-内酰胺的比例极高。LSsp3酶在活性位点的血红素铁附近有着六个变异的氨基酸基团。 作者根据这只P411酶变体测试了一系列的底物,表现了此变体在催化生成比δ-内酰胺环张力更大的β-内酰胺时出色的区域/立体选择能力,之后他们成功合成且提纯了数量更大的其它内酰胺产物。
       Inha Cho团队在定向进化上继续深入,制成了更多种类的内酰胺合成酶,可以用来催化δ-内酰胺 (LSSP3),β-内酰胺(LSβ) 以及γ-内酰胺(LSγ)。在最后的例子中作者表现了催化流程的可控性,作者选择了有三个易反应的sp3碳-氢键的氮宾前体,成功使用了三种不同的内酰胺合成酶选择性地制成了δ,β以及γ内酰胺产物。
       Inha Cho团队在寻找可控的活化碳氢键催化剂中迈出了关键性的一步,甚至在结构灵活的底物上也能被成功催化,这一研究成果是十分可观的,然而如何改善反应时严格的厌氧环境需求是下一个要攻克的技术难题。综上所述,Inha Cho团队的工作清晰地表现了酶的定向进化对碳氢键活化反应带来的发展。在化学,立体以及区域选择性上的高度可控性能让我们从常见的反应物中获得多种珍贵的手性内酰胺。

 
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图1.经不同的内酰胺合成酶催化后的手性内酰胺产物







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